Σύγκριση αποτελεσματικότητας διδύναμων εμπορικών και πειραματικών εμβολίων κατά της δονακίωσης και φωτοβακτηριδίασης στη τσιπούρα Sparus aurata (L.): ανοσολογική διερεύνηση με τη μέθοδο ELISA

Abstract

Η φωτοβακτηριδίαση και η δονακίωση είναι δύο σημαντικές σηψαιμικές νόσοι των ψαριών που προκαλούνται από τα βακτήρια Photobacterium damselae subsp piscicida (εν συντομία Phdp, προηγουμένως Pasteurella piscicida) και Vibrio anquillarum (διάφοροι ορότυποι), αντίστοιχα. Προσβάλλουν σχεδόν όλα τα ευρύαλα εκτρεφόμενα και άγρια ψάρια με τη σοβαρότητα της εκδήλωσης των ασθενειών να εξαρτάται και από το είδος του ψαριού. Η πρόληψη των ασθενειών αυτών γίνεται, εκτός των διαχειριστικών μέτρων, με εμβολιασμό με εμπορικά εμβόλια. Η μελέτη αυτή έγινε με σκοπό τη σύγκριση της αποτελεσματικότητας δύο εμπορικών και δύο πειραματικών εμβολίων κατά της φωτοβακτηριδίασης και της δονακίωσης, καθώς και την ανοσολογική διερεύνηση – ανάλυση αντισωμάτων με την μέθοδο ανάλυσης ELISA. Για την επίτευξη του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν ανεμβολίαστες τσιπούρες ιχθυοτροφείου. Τα εμπορικά εμβόλια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το Alpha Ject 2000 (AJ) και το Aqua Vac Vibrio Pasteurella (AV). Και τα δύο είναι διδύναμα εμβόλια ως προς τα είδη βακτηρίων που περιέχουν (το Aqua Vac Vibrio Pasteurella τριδύναμο γιατί περιέχει δύο ορότυπους του V. anquillarum) και περιέχουν αδρανοποιημένες καλλιέργειες του βακτηρίου V.anquillarum (ορότυπος Ο1 ή/και Ο2) και του Phdp. Τα πειραματικά εμβόλια που χρησιμοποιήθηκαν είχαν ως εξής: το ένα (Eph) ήταν μονοδύναμο και περιείχε αδρανοποιημένες με φορμόλη καλλιέργειες μόνο του Phdp. Το δεύτερο (Evip) ήταν δίδυναμο και περιείχε αδρανοποιημένες με φορμόλη καλλιέργειες των βακτηρίων V.anquillarum (ορότυπος Ο1) και Phdp. Η αποτελεσματικότητα των εμβολίων μελετήθηκε με πειραματικές μολύνσεις που έγιναν δύο μήνες μετά τον εμβολιασμό. Η πρώτη πειραματική μόλυνση με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση έγινε με το βακτήριο V.anquilllarum και η δεύτερη έγινε την ίδια περίοδο με το Phdp. Το σχετικό ποσοστό επιβίωσης (RPS), όσον αφορά τη μόλυνση με το V.anquillarum, ήταν μεγάλο σε όλα τα εμβόλια, με το AV και το AJ να δίνουν 92% και το Evip 100% επιτυχία. Αντιθέτως, στη μόλυνση με το Phdp, τα ποσοστά επιβίωσης δεν ήταν ικανοποιητικά. Το AV έδωσε αρνητικό ποσοστό, ενώ τα Eph και Evip 0%, αφού η θνησιμότητα ήταν ίδια ακριβώς με τα ψάρια μάρτυρες. Τέλος, το AJ είχε 100% επιτυχία.Κατά τη διάρκεια ολόκληρου του πειράματος συλλέχθηκε αίμα από όλες τις ομάδες των εμβολιασμένων και εμβολιασμένων/μολυσμένων ψαριών και απομονώθηκε ο ορός. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των αντισωμάτων έγινε με την ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA). Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με χρήση του εργαλείου σταστιστικών υπολογισμών R μέσω εκτίμησης Kaplain – Meier και με χρήση των τεστ ANOVA και LSD. Στην ανοσολογική ανάλυση των ορών αίματος, τις μεγαλύτερες μέσες τιμές αντίδρασης σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ομάδες τις έδωσε το εμπορικό εμβόλιο Alpha Ject 2000 τόσο στα εμβολιασμένα όσο και στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα ψάρια έναντι και των δύο βακτηρίων. Οι τιμές των τίτλων αντισωμάτων δεν ήταν απλά πιο υψηλές, είχαν και σημαντική στατιστική διαφορά σε σύγκριση με τις τιμές των υπόλοιπων εμβολίων αλλά και με τα ψάρια μάρτυρες.Στα εμβολιασμένα ψάρια τη μεγαλύτερη τιμή αντίδρασης με το V.anquillarum την έδωσε το AJ, ενώ τα εμβόλια AV και Evip ήταν στα ίδια περίπου επίπεδα. Αντίστοιχα, η μεγαλύτερη τιμή αντίδρασης στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα ψάρια με V.anquillarum ήταν στο AJ, ενώ τα εμβόλια AV και Evip ήταν περίπου στα ίδια επίπεδα. Τα ψάρια μάρτυρες είχαν τις χαμηλότερες τιμές τίτλων αντισωμάτων. Επίσης, σημαντικά υψηλότερη στατιστική διαφορά είχαν οι εμβολιασμένες ομάδες ψαριών που κατόπιν μολύνθηκαν σε σύγκριση με τις αντίστοιχες ομάδες των απλά εμβολιασμένων ψαριών, εκτός από τις ομάδες που είχαν εμβολιαστεί με το AJ. Αντίστοιχο μοτίβο είχαν και τα αποτελέσματα με το Phdp. Το AJ είχε πάλι τη μεγαλύτερη τιμή αντίδρασης στα εμβολιασμένα, ενώ τα εμβόλια AV, Evip και Eph ήταν περίπου στα ίδια επίπεδα. Τις υψηλότερες τιμές αντίδρασης τις είχε επίσης το AJ στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα με Phdp ψάρια και αντίστοιχα οι μάρτυρες είχαν τις χαμηλότερες τιμές. Και σε αυτές τις δύο περιπτώσεις το AJ είχε σημαντική στατιστική διαφορά από τις υπόλοιπες ομάδες. Αντιθέτως, όπως και στην ανάλυση με το V.anquillarum, οι εμβολιασμένες ομάδες ψαριών που στη συνέχεια μολύνθηκαν με το Phdp, είχαν σημαντικά υψηλότερη στατιστική διαφορά με τις αντίστοιχες απλά εμβολιασμένες ομάδες, με εξαίρεση τις ομάδες των εμβολίων AJ και Evip. Το συμπέρασμα που προκύπτει από τα αποτελέσματα είναι ότι το διδύναμο εμπορικό εμβόλιο AJ είχε την ισχυρότερη ανοσοποιητική δύναμη σε σύγκριση με τα υπόλοιπα. Οι τίτλοι αντισωμάτων που υπολογίστηκαν ήταν αρκετά υψηλότεροι των υπολοίπων και είχαν σημαντική στατιστική διαφορά. Οι αυξημένοι τίλτοι αντισωμάτων μετά την πειραματική μόλυνση συνδέονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής μνήμης. Η ανοσολογική μνήμη θεωρείται πολύ σημαντικό κομμάτι της ανοσολογικής αντίδρασης. Η κατάσταση μνήμης μπορεί να χαρακτηριστεί από την ανάπτυξη μιας αυξημένης ευαισθησίας στο αντιγόνο.

Photobacteriosis and vibriosis are two important septicemic fish diseases that are caused from the bateria Photobacterium damselae subsp piscicida (formely known Pasteurella piscicida) and Vibrio anquillarum (different serotypes), respectively. These bacteria infect almost all euryhaline farmed and wild fish and the seriousness of the outbreaks depend also from the fish species affected. Prevention of the disease is carried out though application of hygiene measures and through vaccination with commercial vaccines. The aim of this project was the comparison of the efficacy of two commercial and two experimentals vaccines administered by intraperitoneal injection in preventing photobacteriosis and vibriosis in sea bream. In addition, to analyse the immune response elicited by these vaccines through measurement of specific antibody titres using ELISA techniques. The commercial vaccines used were Alpha Ject 2000 (AJ) and Aquavac Vibrio Pasteurella (AV). Both of them are bivalent and contain inactivated cultures of V.anquillarum (serotypes O1 and O2) and Phdp (the vaccine Aquavac Vibrio Pasteurella is trivalent beacause contains two serotypes of V.anquillarum).The experimental vaccines used were: the first (Eph) was monovalent, contained only inactivated cultures of Phdp. The second one (Evip) was bivalent, contained inactivated cultures of V.anquillarum (serotype O1) and Phdp.Fish were experimentally infected by intraperitoneal injection two months after vaccination. During the experiment blood collected from all the fish groups, vaccinated and infected, and the serum was isolated. Quantitative determination of specific antibody titres was performed by an enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA). The results were analyzed with the statistical program R through the Kaplain – Meier estimate with the ANOVA and LSD tests. In the immunological analysis of the blood serum, the commercial vaccine AJ had the highest reaction compared to the rest groups in both vaccinated group and vaccinated and infected with both bacteria groups. Values of the antibody titers weren’t only high but also they had significant statistical difference compared to other vaccinate groups and controls. In vaccinated fish, AJ had the highest reaction value with the V. anquillarum and the AV and Evip vaccines had values at the same but lower levels. In addition, AJ had also the highest value at the vaccinated and infected fish with V. anquillarum, and AV and Evip vaccines were at the same but lower levels. Control fish had the lowest values of antibody titers. Also, significantly higher statistical significance had vaccinated and infected fish groups compared to the corresponding groups of only vaccinated fish, except the groups vaccinated with AJ. The same pattern was seen also against Phdp. Alpha Ject 2000 had also the highest value at the vaccinated fish and vaccinated but infected fish with significant statistical difference. The rest of vaccines (AV, Evip, Eph) were in the same lower level and controls had the lowest reaction values. Conversely, as the analysis with V.anquillarum, the vaccinated and infected with Phdp groups, had significantly higher statistical difference with just vaccinated groups, except the groups of vaccines AJ and Evip. The conclusion drawn from the results is that the bivalent commercial vaccine AJ privided the stronger immune stimulation compared to the others. The antibody titers were quite higher than the rest with significant statistical difference. Increased antibody titers after experimental infection are associated with the development of immunological memory. Immunological memory is considered a very important part of the immune response.